有机磷^{[有机磷农药可因食入吸入或经皮肤吸收而中毒小儿中毒原因多为：误食被有机磷农药污染的食物（包括瓜果蔬菜乳品粮食以及被毒死的禽畜水产品等）；误用沾染农药的玩具或农药容器；不恰当地使用有机磷农药杀灭蚊蝇虱蚤臭虫蟑螂及治疗皮肤病和驱虫；母亲在使用农药后未认真洗手即换衣服而给婴儿哺乳；用包装有机磷农药的塑料袋做尿垫或用喷过有机磷农药的田头砂土填充”土包裤”代替尿垫等；儿童亦可由于在喷过有机磷农药的田地附近玩耍引起吸入中毒…]}农药^{[农药，是指农业上用于防治病虫害及调节植物生长的化学药剂。]} （organophosphorus pesticides，OPPs） 是一类含 C—P、C —O—P、C—S—P等基团的化合物，由于具有高效、广谱、经济、易降解等特点，被广泛用于农业和畜牧业，主要用来除虫、杀菌、杀螨、驱杀动物体内和体外的寄生虫，成为继有机氯农药之后农业生产中主要使用的农药品种之一。有机磷农药能够抑制乙酰胆碱^{[乙酰胆，是一种神经递质。]}酯酶活性，易对人体或者动物造成急性中毒，是一类具有全身多脏器毒性的污染物。随着有机磷农药在农业生产中的广泛使用，其对人类健康产生了不容忽视 的影响。目前我国一些食品如茶叶、大米、肉、蛋等中可检测到有机磷农药残留^{[残留，少量地遗留下来。]}，过多的残留量会对人体健康造成危害。本部分综述了有机磷农药的性质、作用机理与危害以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 性质、结构及分类

有机磷农药除少数品种为固体（如乐果、敌百虫^{[敌百虫学名O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)膦酸酯，中文别名:敌百虫可溶性粉剂;敌百虫兽用;敌百虫原粉;二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯;精制敌百虫一种有机磷杀虫剂。]}）外，多数为油状液体，工业品呈淡黄色至棕色，具有大蒜样特殊臭味。一般不溶于水，而溶于多种有机溶剂及油中，稳定性较差，特别是在碱性中更不稳定，所以不宜与碱性药剂混用。

有机磷农药大多数品种为磷酸酯类或硫代磷酸酯类化合物，其结构通式见图6-3。

式中，R1、R2在我国目前生产的品种中多为甲氧基 （CH3O） 或乙氧基 （C2H5O）；X 为氧（O）或硫（S）**；Z为烷氧基、苯氧基或其他更为复杂的取代基团。由于取代的基团不同，可产生多种多样的化合物。

有机磷农药按结构可分为磷酸酯、膦酸酯和磷酰胺及其相应的硫代衍生物。如常见有机磷农药: 敌敌畏属磷酸酯类，乐果属二硫代磷酸酯类，敌百虫属膦酸酯类，即膦酸（磷酸中一个羟基被有机基团置换，形成C—P键）中羟基的氢**被有机基团取代形成。

2 作用机理及危害

有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树、蔬菜上，在兽医临床上作为传统杀虫药，广泛用于畜禽体外寄生虫病。虽然它比有机氯农药较易降解，残留期较短，但有机磷农药进入有机体后，大部分对生物体内胆碱酯酶有抑制作用，使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱，从而导致机体的损害。

有机磷农药是通过与胆碱酯酶的活性内羟基结合来抑制酶活性的。如典型的有机磷酸酯与胆碱酯酶的结合如图6-4所示（以二异丙基磷酰氟为例）:

乙酰胆碱酯酶是催化乙酰胆碱水解的一种酶。乙酰胆碱是一种神经传递物质，在神经冲动的传输中起着重要的作用。对于正常的神经冲动，乙酰胆碱存在时，传递神经冲动，使人兴奋，当它在乙酰胆碱酯酶的催化下被水解掉（式Ⅱ）（图6-5），冲动就休止。

但有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的结合对乙酰胆碱酯酶的活性造成了不可逆的抑制，从而失去了原有的催化乙酰胆碱水解的功能，造成乙酰胆碱的积累，使神经过分**，冲动不能休止，引起机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状，甚至死亡。

3 样品前处理方法

由于动物源性食品具有形态多样、组成复杂而且待测物含量较低的特点，必须经过前处理后才能进行各种仪器分析。样品前处理起着浓缩被测痕量组分、提高方法灵敏度^{[灵敏度（Sensitivity）是指某方法对单位浓度或单位量待测物质变化所致的响应量变化程度，它可以用仪器的响应量或其他指示量与对应的待测物质的浓度或量之比来描述。]}及去除对分析系统有害物质的作用，包括待测物的提取^{[通过溶剂（如乙醇）处理、蒸馏、脱水、经受压力或离心力作用，或通过其他化学或机械工艺过程从物质中制取有用成分（如组成成分或汁液）。]}、净化^{[净化是指清除不好的或不需要的杂质，使物品达到纯净的程度。]}和浓缩。前处理的关键是除去与目标分析物同时萃取出来的大分子有机杂质，如蛋白质、脂肪酸、甾醇、甘油酯、色素等。多数有机杂质虽然在选择性检测器^{[检测器指能检测色谱柱流出组分及其量的变化的器件。]}上基本不干扰目标药物的响应，但是如果前处理方法不能较完全地除去油脂和色素等物质，便会污染检测仪器，使得色谱柱柱效降低，检测灵敏度受到影响。

此外，除了基质干扰影响因素外，温度也是动物源性食品中有机磷农药残留检测的影响因素。由于有机磷农药对温度有很强的敏感性，受热会加速分解过程，因此在前处理过程提取完全和有效净化的前提下，应加强温度的控制。张金虎等通过温度对比试验发现，水浴浓缩和氮吹的温度高于35℃时，甲胺磷^{[甲胺磷（Methamidophos），是一种有机磷化合物，通常用作农药，在台湾的商品名为达马松、在中国**的商品名为多灭灵。]}、敌敌畏和**乐果的回收率^{[回收率包括绝对回收率和相对回收率。]}明显降低，在30%~50%；而当温度控制在25~30℃时，有良好的加标回收效果，样品回收率为63.2%~104.8%，RSD为1.6%~7.1%。

3.1 提取

3.1.1提取溶剂

样品提取总的要求是尽可能完全地提取出所含农药成分，尽量少地提取出干扰物质。有机磷农药是亲脂性化合物，易溶于有机溶剂。在选择提取溶剂时，应当根据“相似相溶原理”选择和待测农药极性相近的溶剂，并且提取剂不能与样品发生反应。对极性小的农药，可以用非极性溶剂来提取，也可用混合溶剂来提取；对含水量较高的样品，宜用极性溶剂。常用的提取剂有丙酮、石油醚、甲醇、苯、乙酸乙酯^{[乙酸乙酯是无色透明液体，低毒性，有甜味，浓度较高时有**性气味，易挥发，对空气敏感，能吸水分，使其缓慢水解而呈酸性反应。]}、环己烷、二氯甲烷和三氯甲烷等。

对于成分更为复杂的动物组织中有机磷农药提取的文献报道不多，其提取溶剂多为乙腈、乙酸乙酯或环己烷-乙酸乙酯、丙酮-二氯甲烷等混合溶液。其中丙酮-二氯甲烷混合提取应用较为普遍，但不同文献所用提取液的混合比例不同。

由于二氯甲烷毒性较大，Juhler用乙酸乙酯提取了动物性脂肪中的甲胺磷、对硫磷、内吸磷等13种有机磷农药；Mario以对氨基苯甲酸二乙基醋酸盐溶液作为提取液，提取了人体组织样品中的敌敌畏、甲胺磷、毒虫畏等37种有机磷农药；GB/T 19650—2006以环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）提取动物肌肉中的478种农药，其中包括甲胺磷等多种常用有机磷农药，提取效果均较好。刘琪等通过试验证明用乙酸乙酯提取猪肝中有机磷农药的效果最好，提取液干净、杂质少，同时去除了样品中的水分和色素。朱青青等建立了蜂蜜中敌百虫、毒死蜱、蝇毒磷、皮蝇磷和马拉硫磷残留的检测方法，试验发现，乙酸乙酯和乙腈对各种有机磷农药都有很好的提取效率，考虑到乙腈浓缩时要求的温度较高，敌百虫不稳定，回收率会偏低，同时乙腈毒性大，选用乙酸乙酯作为提取溶剂，5种有机磷农药残留的回收率为79%~95%。

不同提取溶剂的对比研究也有报道。林竹光等分别以二氯甲烷、丙酮、正己烷^{[正己烷，是低毒、有微弱的特殊气味的无色液体。]}-丙酮（1∶1，V/V）、正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、乙酸乙酯和乙腈作为提取剂进行了牛奶中有机磷农药残留检测的对比试验，结果表明:除乙腈外，其他的提取剂均提取出大量的脂肪，对后续的净化过程造成较大的影响。刘祥国等进行了乙腈、丙酮等有机溶剂及溶剂配比提取羊肉组织中有机磷农药残留量回收率试验。结果发现，乙腈提取获得了良好的效果（表6-2）。

3.1.2提取方法

提取农药的方法很多，除了浸渍、漂洗、匀浆、捣碎法和机械振荡等常规LLE方法及索氏提取法外，近年来还发展了超临界流体萃取（SFE）、加速溶剂萃取（ASE）、超声波萃取法、微波辅助萃取（MAE）等新技术。

王耀等利用ASE，采用高温高压模式，增加物质溶解度和溶质扩散效率，建立了咸鱼中有机磷农药残留的前处理方法，具有萃取效率高、用时短、选择性好、溶剂用量少及自动化程度高等优点。

Frenich等对鸡肉、牛肉、猪肉等基质中的乙酰甲胺磷、二嗪农等有机磷农药残留进行了检测，比较了LLE、索氏提取、ASE 3种前处理方式的萃取效率。试验证明，3种提取方法回收率均在97.8%以上，但索氏提取费时费力、ASE设备昂贵，LLE经济适用，可作为常规提取方法用于样品前处理。

3.2 净化

净化是减少基质影响、提高方法特异性的有效手段。动物源性食品中有机磷农药残留分析净化技术的关键是去除脂肪。有机磷农药的稳定性较差，不适合采用传统的浓硫酸除脂净化的方法。凝胶渗透色谱（GPC）、固相萃取（SPE）和基质分散固相萃取（MSPDE）能够在温和的条件下去除动物源性食品中的脂肪分子，是动物源性食品中有机磷农药残留分析的主要净化手段。

3.2.1 凝胶渗透色谱（GPC）

GPC 由Moore于1964年首先研制成功，主要原理是根据不同体积的分子在凝胶色谱柱上保留的时间差异，来分离净化目标物。GPC净化可有效去除样品中的脂类、色素、蛋白质等大分子干扰物，其分离效果与分子极性无关，常用于脂肪含量较高的动物源性食品的净化。GPC在动物源性食品中农药残留检测方面是一种成熟、传统的净化技术。

Frenich等以GPC为净化技术，对鸡、猪、羊等动物肝脏中的有机磷农药残留进行了检测，回收率为70%~110%。陈惠京等采用自制凝胶净化柱，对肉、蛋、牛奶中乐果、久效磷等13种有机磷农药进行了净化，回收率为78.9%~108.2%，RSD为3%~12%。《动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》（GB/T19650—2006）中也以GPC作为样品净化技术。王耀等采用GPC净化提取液，结果表明:脂类、蛋白质及绝大多数色素干扰物在9min内流出GPC柱（图6-6A）；而17种有机磷目标物在9~15min流出（图6-6B）。咸鱼样品中的干扰物与17种有机磷农药能有效分离。

水产品体内由于富含油脂类物质，常规提取方法通常较复杂且效果不理想。段建发等利用GPC对鳗样品进行了处理，结果显示样品前处理简便，净化去脂效果好，方法检测限为0.01~0.02mg/kg，回收率为76.3%~106.8%。此外，由于惰性微球表面对有机物吸附小，GPC还具有柱污染程度轻、脱盐等优点。

3.2.2 固相萃取（SPE）

SPE是一种应用较多的样品前处理技术，它根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱子后，将样品中某一组份保留在柱中，再选择合适的溶剂把保留在柱中的组分洗脱下来，从而达到分离、净化的目的。

与常规净化方法相比，SPE具有分离效率高、使用方便、快速、重复性好、节省经费、安全、缩短预处理的时间等优点；而且还可选择不同类型的吸附剂^{[吸附剂也称吸收剂。]}和有机溶剂用于处理各种不同类别的有机污染物。SPE因而在农药残留特别是在脂肪和蛋白质含量高的复杂样品中农药残留物及农药多残留的分离、提取、净化和浓缩方面得到了广泛应用。全自动高通量SPE仪的出现进一步增强了SPE的处理能力。

动物源性食品中有机磷农药残留检测常用的SPE柱有C18柱、N-丙基乙二胺（PSA）柱、弗罗里硅土（Florisil）柱、氨基柱和**铝柱等。其中C18柱对油脂分子的去除效果最为理想，应用也最为广泛，在牛奶、肌肉、肝脏、脂肪等动物性基质的有机磷农药残留检测中均有应用。

为了加强净化效果，可以将不同的SPE柱串联使用。在动物源性食品中有机磷农药残留检测的样品前处理中，C18柱与PSA柱组合净化效果好，应用最为广泛。苏建峰采用该组合检测了猪肉中的63种有机磷农药，回收率为70%~121%。Schenck利用石墨化碳黑SPE柱与氨丙基SPE柱串联去除鸡蛋中的色素和脂肪，检测了28种有机磷农药残留，回收率为61%~149%。张金虎等通过对比弗罗里硅土柱、氨基柱、**铝柱、C18柱的研究发现，C18柱的去油脂效果良好，而PSA柱可以去除色素等杂质的干扰，两者结合可达到良好的分离净化效果。刘琪等采用石墨化碳黑/N-丙基乙二胺（Carb/PSA）柱处理、净化猪肝样品，净化效果更好，对有机磷农药的回收率较高，可有效去除样品中杂质的干扰。王耀等也采用Carb/PSA柱处理咸鱼样品，比较了丙酮-正己烷（1∶1，V/V）和乙腈-甲苯（3∶1，V/V）两种洗脱剂的洗脱效果，结合丙酮-正己烷毒性较小且沸点较低的优点，选用丙酮-正己烷为洗脱剂，达到了良好的净化效果，样品回收率为64.5%~98.6%。

3.2.3 基质固相分散（MSPD）

MSPD是1989年首次提出的一种萃取技术。其基本操作是将试样直接与适量反相填料（C14或C18）研磨、混匀制成半固态装柱后淋洗。MSPD浓缩了样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，不需要进行组织匀浆、沉淀、离心等操作步骤，避免了样品的损失，是简单高效的提取净化方法，适用于各种分子结构和极性农药残留的提取净化。此外，MSPD减少了试剂的用量，更适合于自动化分析。

Liasera等用C18键合硅胶颗粒作为吸附剂，提取了牛的肌肉组织和肝组织中的毒死蜱、毒虫畏、二嗪农、杀螟硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药残留，除了肝脏中毒虫畏的回收率为55%以外，其他有机磷农药回收率均在94%以上，检测限最低可低于100μg/kg。Lehotay等用C18和无水硫酸钠作为吸附剂，与弗罗里硅土柱串联，检测了高脂肪含量动物源性食品中的有机磷农药残留，结果表明强极性的有机磷农药回收率较差，中等极性和弱极性的有机磷农药回收率均在100%左右。金珍等将超声辅助提取和MSPDE相结合，测定鱼肉中的有机磷农药残留，并和传统的MSPDE进行了比较，而且对提取溶剂做了优化，回收率为66.6%~102.2%。薛平等研究了3种吸附剂（中性**铝、弗罗里硅土、硅胶）对19种有机磷农药测定结果的影响。并以弗罗里硅土为吸附剂，吸附剂与样品的比例为4∶1，以乙酸乙酯作为洗脱剂，洗脱体积10mL，建立了鸡肉中19种有机磷农药残留分析的MSPD的样品净化方法。结果表明，除了添加水平为0.01mg/kg时，乙拌磷、杀螟腈、水胺硫磷、硫线磷、三唑磷的回收率较差，其余有机磷农药的回收率均为75.0%~10.92%，相对标准偏差小于16%。

除了以上净化技术外，固相微萃取、搅拌棒萃取和超临界流体萃取在动物源性食品有机磷农药残留检测方面也有应用。尤其是固相微萃取和搅拌棒萃取，能够大幅度地提高萃取效率，可以使检测仪器的灵敏度提高1~2个数量级。Heleni等利用搅拌棒萃取和GC-FPD（光焰光度检测器）联用仪分析了蜂蜜中的马拉硫磷等5种有机磷农药，检测限为0.013~0.081μg/kg。

4 检测方法

目前，对于动物源性食品中有机磷农药残留检测，国内外文献报道较多的是色谱分析方法，包括配备各种特异性检测器的GC法、GGMS法、LC法、LC-MS法等。

GC法及GGMS法作为一种成熟可靠的有机磷农药检测技术，应用最为广泛。GC仪是有机磷农药残留分析中最常用的检测设备，是建立动物源性食品中有机磷农药残留检测的主要技术手段。常用的检测器主要有氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）。虽然NPD的灵敏度很高，但由于其存在色谱峰拖尾现象较严重的缺点，实际应用更多的是FPD（表6-2）。

随着新技术的不断改进，在FPD基础上发展起来一种新型检测器———脉冲火焰光度检测器(PFPD），该检测器因高抗干扰能力、高灵敏度等优点，在动物源性食品有机磷农药残留检测中得到应用。PFPD工作原理是以脉冲点火的方式，利用碳氢化合物和磷、硫离子发出荧光的时间差异，降低了基质干扰，大幅度提高了仪器灵敏度。对于有机磷农药检测，PFPD的响应要比NPD和FPD的灵敏度高10倍左右，而且不存在峰形拖尾现象。Zrostlikova等用PFPD检测了动物脂肪中的12种有机磷农药，检测限为10~20μg/kg。虽然配备特定检测器的GC具有高灵敏度的特点，但是GC法仍存在定性准确性较差的缺点。GC-MS和GC-MS/MS结合了色谱的高效分离能力以及质谱的确证技术，能够了解更多的分子结构信息，大大提高了定性的准确性，是动物源性食品中有机磷农药残留检测常用的定量方法和确证技术（表6-3）。

通常情况下，电子轰击源（EI源）全扫描模式可以得出化合物的全扫描质谱图，但灵敏度较差，主要用于农药残留的定性分析，选择特征离子扫描模式能大大提高检测灵敏度，可以选取碎片离子进行监测，其中一个是定量离子，以满足化合物确证的要求。

化学源的离子碎片不如EI丰富。Mario等采用负化学源（NCI）-SIM模式分析了人体肝、肾组织中的甲胺磷、倍硫磷等37种有机磷农药残留，检测限为0.01~0.09μg/kg。Stan采用CI源的脉冲正负离子化模式，结合了正化学源定量高灵敏度的特点和NCI定性高可靠性的特点，建立了72种有机磷农药残留的确证检测方法。

与GC-MS相比，GC-MS/MS进一步提高了检测灵敏度，降低了仪器对源模式选择的依赖性。Frenich等采用EI源的四级杆串联技术检测猪肉、鸡肉、羊肉中的有机磷农药残留，检测限为0.02~0.49μg/kg。

此外，有些有机磷农药由于具有极性强、挥发性低及热不稳定的特点，不能直接使用或不适合用GC分析，在实际工作中，也有报道采用LC法和LG-MS法测定动物源性食品和生物学样品中的有机磷农药残留。例如敌百虫具有热不稳定性，对硫磷在气相色谱上容易形成峰拖尾等，利用LC可以避免上述现象的发生。刘琪等建立了猪肝组织中敌百虫等7种有机磷农药残留的UPLC-MS/MS测定方法。采用甲醇-10mmol/L乙酸铵为流动相，电喷雾正离子模式（ESI＋）电离，MRM模式，有机磷农药的离子化效率最高，在正离子模式下能获得丰度较高的准分子离子峰和子离子峰，色谱峰形好，灵敏度高，方法的检出限为5μg/kg，回收率为70%~92%。